thinkpool

텔로미어 표적화 약물 KML001,

신경 모세포종 세포를 테모 졸로이드 화학 요법과 방사선 요법으로 DNA 손상과 세포 사멸로 민감화

아교 모세포종의 표준 치료법은 수술 적 절제술, 테모 졸로 마이드의 화학 요법 및 방사선 요법으로 구성됩니다. 그럼에도 불구하고 대부분의 아교 모세포종 환자는 세포 독성 재래의 치료법에 대한 저항성으로 재발한다. 우리는 glioblastoma의 chemoradiation therapy의 치료 한계를 극복하기 위해 glioblastoma 세포주와 이종 이식 모델에서 temozolomide 또는 방사선 조사로 염색체의 텔로미어를 표적으로하는 비소 화합물 KML001의 조합 효과를 조사했다.

KML001만이 아교 세포종 생존에 거의 영향을 미치지 않았지만, 체외 테모 졸로 마이드 치료 또는 방사선 조사에 의한 세포 사멸은 KML001과의 병용에 의해 상승적으로 상승했다. 인산화 된 γ-H2AX, 절단 된 casepase-3 및 절단 된 PARP가 KML001에 의해 극적으로 증가 되었기 때문에, 상승 효과는 DNA 손상 및 후속 종양 세포 사멸에 의해 매개 될 것이다.

KML001의 조합 효과는 화학 및 방사선 감수성 아교 모세포종 세포주 U87MG뿐만 아니라 내성 세포주 U251MG에서도 관찰되었다. U87MG 아교 모세포종 이종 이식 모델에서 KML001은 전신 독성을 가지지 않았지만 테모 졸로 마이드 또는 방사선 조사와 병용시 시너지 효과가있어 종양의 부피를 현저하게 줄였다.

이러한 데이터는 KML001이 아교 모세포종에 대한 통상적 인 세포 독성 치료의 치료 효과를 강화시키는 후보 감작 제라는 것을 나타냈다.
1. 소개

신경 아세포종 (Glioblastoma, GBM)은 악성 형태의 원발성 뇌종양으로, 공격적인 암세포 증식, 인접한 정상 뇌 조직으로의 강력한 침습성 및 대규모 혈관 신생을 나타냅니다 [1]. GBM 환자에 대한 현재의 표준 요법은 DNA 메틸화제 인 temozolomide (TMZ)를 사용하여 수술 적 제거 후 분획 방사선 치료와 화학 요법입니다. 그럼에도 불구하고 GBM 환자의 평균 생존율은 치료없이 4 개월, 표준 요법에서 15 개월로 알려져있다.

TMZ는 구아닌 잔기의 N7 또는 O6 위치에서 주로 일어나는 DNA를 알킬화 / 메틸화하는 능력을 갖는다. 메틸화는 DNA 가닥 붕괴를 유도하고 세포 사멸 종양 세포 사멸을 유발합니다. 방사선 치료는 또한 암 세포에서 DNA 이중 가닥 파손을 유도하여 더 증식하는 능력을 차단합니다 [3, 4]. 그러나 화학 요법과 방사선 요법은 DNA 복구가 역할을 할 수있는 다양한 저항 기전을 유발하는 것으로 알려져있다 [5-9]. 증가 된 DNA 복구 단백질 인 O6- 메틸 구아닌 -DNA 메틸 전이 효소 (MGMT)는 GBM에서 TMZ 내성과 관련이있다 [10, 11]. DNA 불일치 복구 단백질 인 MSH6의 결실은 테모 졸로이드 + 전리 방사선 치료 GBMs의 재발에서도 발견된다. Rad51 매개 형 상 동성 직접 수복 (HDR)의 중단 또는 G2 검사 점 활성화의 예방은 선택적으로 GBM 세포를 방사선에 민감하게 만든다. 따라서 이러한 TMZ 및 방사선 요법에 대한 내성은 회복 할 수없는 DNA 손상을 통해 극복 될 수 있습니다.
1. sogae
GBM에서 방사선 요법 및 / 또는 TMZ 화학 요법 내성을 극복하기위한 다양한 조합 전략이 연구되었다 [14-16]. 다양한 고형 종양에서 효과적인 화학 요법 제로 사용 되어온 비소 화합물 중 일부는 실행 가능한 후보 물질이 될 수 있습니다 [17-19]. 그 중에서도 나트륨 아인산 칼륨 인 KML001은 텔로미어 표적제로서 임상 소아마비에 진행성 비소 세포 폐암 및 기타 백금 반응성 악성 종양의 1 상 임상 시험에 진입했다. KML001은 염색체의 텔로미어를 직접 표적으로 삼아 전립선 암세포의 DNA 손상 신호 전달 및 텔로미어 침식을 촉진한다. 또한,이 약제는 다양한 종양 모델에서 이리노테칸과의 병용 치료에서 상승 작용 항암 활성을 보였다 [21-23]. KML001은 DNA 손상과 세포 사멸을 증가시키기 때문에 KML001에 의한 DNA 손상을 통해 TMZ 화학 요법과 GBM에 대한 내성을 극복 할 수 있습니다

여기서 우리는 GBM에 대한 기존 치료법의 충족되지 못한 요구를 해결할 수있는 솔루션을 제공하는 TMZ 또는 방사선과 결합 된 텔로미어 표적 화제 KML001의 시너지 효과를보고했다.

2. 재료 및 방법


2.1. 세포 배양 및 시약

인간 GBM 세포주 인 U251MG 및 U138MG (미국 형질 세포 배양 물, ATCC, Manassas)를 둘 베코 변형 배지 (DMEM)에서 배양하고, U87MG 및 U373MG (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas) MEM). 모든 배지에 10 % 태아 소 혈청 (FBS, Gibco, USA), 페니실린 (100 units / mL, Gibco) 및 스트렙토 마이신 (100㎍ / mL, Gibco)을 보충 하였다. 이 세포들은 5 % CO2로 연속적으로 씻어내는 배양기에서 37 ° C로 유지되었다.

KML001 (Sodium meta-arsenite)은 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하였고 100 mmol / L 원액은 1X phosphate buffered saline (PBS, Gibco)에서 제조 하였다. 작업 농도는 PBS로 주식을 희석하여 매일 새롭게 준비되었습니다. Temozolomide는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 10 % dimethyl sulphoxide (DMSO, Sigma-Aldrich)에 용해시켰다.

2.2. 콜로니 형성 분석

U251MG, U373MG 및 U138MG (100 세포 / 2mL 배지)를 6- 웰 플레이트에 시딩하고 U87MG를 100mm 배양 접시 (1000 세포 / 10㎖ 배지)에 시딩 하였다. 24 시간 후 세포를 KML001 (0.01, 0.01, 4, 8, 10 및 100 μM), 테모 졸로 미드 (10 및 20 μM) 또는 방사선 조사 (1, 2, 3 및 4 Gy)로 처리 하였다. 10 일 동안 배양 한 후, 모든 세포를 100 % 메탄올로 고정시키고 0.01 % 또는 0.125 % 크리스탈 바이올렛 (Sigma-Aldrich)으로 염색 하였다. 50 개 이상의 세포를 함유하는 콜로니를 클론 성 세포의 대표자로서 계수 하였다. 생존율은 다음 공식을 사용하여 계산되었다. ((처리 후 형성된 콜로니의 수) / (접종 된 세포의 수 × 도금 효율)) 여기서 도금 효율은 접종 된 세포의 수에 대한 콜로니의 수이다 [24].
2. jaelyo mich bangbeob

2.3. Western Blotting Analysis

세포를 KML001 (5 또는 10 μM) 또는 테모 졸로 미드 (100, 200 또는 400 μM) 또는 방사선 조사 (3, 6 또는 9 Gy)로 48 시간 동안 처리 하였다. 모든 세포를 프로테아제 저해제 칵테일 타블렛 (Sigma-Aldrich)을 첨가 한 NP40 용해 완충액 (50 mM Tris, pH 7.4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 % Nonidet P40, 0.02 % NaN3) ) 및 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, Sigma-Aldrich)가있다. 정량 분석 ？？후, 동량의 단백질을 웨스턴 블 랏팅에 사용 하였다. 토끼 단일 클론 절단 PARP 항체 (1 : 1,000, Cell Signaling Technology, USA)와 토끼 단일 클론 성 카스파 제 -3 항체 (1 : 1,000, Cell Signaling Technology)를 사용하여 세포 자멸 경로 단백질을 확인 하였다. loading control은 mouse monoclonal β-actin 항체 (1 : 5,000, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용 하였다. 항체는 양 고추 냉이 퍼 옥시다아제 결합 2 차 항체 (Santa Cruz Biotechnology)와 Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, UK)로 시각화했습니다.

2.4. 면역 세포 화학

면역 세포 화학 (ICC) 분석을 위해 Nunc Lab-Tek II 챔버 슬라이드 시스템 (Thermo Scientific, USA)에서 U251MG 및 U87MG 세포 (3 × 103 세포 / 웰)를 배양 하였다. 세포를 차가운 1X PBS로 3 회 세척하고 4 % 파라 포름 알데히드로 10 분 동안 고정시켰다. 고정 된 세포를 10 분 동안 0.5 % Triton X-100에서 투과성으로 만들고 실온에서 1 시간 동안 1 % 소 혈청 알부민 (BSA, Santa Cruz Biotechnology)으로 블로킹 한 후 1 차 항체 γ-H2AX (Upstate / Millipore, USA)을 실온에서 1 시간 동안 처리 하였다. 연속적으로, 세포를 Alexa-flour 488 dye-conjugated 2 차 항체 (Invitrogen, USA)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다. 이 세포들은 핵 검출을 위해 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Invitrogen)으로 염색되어 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경 (Carl-Zeiss, Germany)을 사용하여 보았다.

2.5. 이종 이종 종양 모델

KML001, temozolomide 및 생체 내 조사의 효능 시험을 위해 6 주령 암컷 흉선 누드 마우스를 사용하여 두개강 내 주입으로 동측 이종 이식 모델을 확립했습니다. orthotopic 이종 이식 모델을 수립하기 위해 U87MG 세포 (2 × 105 / 5 μL 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS), Gibco)을 생쥐의 왼쪽 striata에 stereotypically 주입했다 (좌표 : AP + 0.5, ML +1.7, DV -3.2 mm 브레그마 출신). 각 그룹에는 8 마리의 마우스가 있었고, 종양 세포 주입 후 1 일째에 마우스를 KML001 (매일 구강을 통해 5mg / kg)에 의해 투여 하였다. 종양 세포 주입 후 18 일에서 22 일에 Temozolomide (2 mg / kg × 5 회 경구 투여)와 전뇌 방사선 조사 (2 Gy × 5). U87MG 세포를 이용한 동측 이종 이식 모델의 평균 생존 기간 인 28 일에 모든 동물을 희생시켰다. 종양 직경은 버니어 캘리퍼스를 사용하여 측정하였고 종양 체적은 다음의 공식을 사용하여 타원체의 부피를 계산하여 결정 하였다 : (길이 × (폭) 2 × 0.5). 생쥐를 희생시킨 후 세포가 뇌실로 유출 된 경우 종양 직경 측정 데이터가 제외되었다.

2.6. 통계 분석

결과는 평균값 ± 표준 편차 (S.D) 또는 표준 노력 (S.E)으로 표현되었다. 통계적 비교는 편차 분석 (ANOVA)과 최하위 차 (LSD) 테스트에 의해 분석되었습니다. P <0.05의 유의 한 수준이 모든 검사에 사용되었다. SPSS-PASW 통계 소프트웨어 버전 18.0이 모든 통계 분석에 사용되었습니다.


3. 결과 및 고찰


3.1. GBM 세포의 생존은 KML001 및 TMZ 또는 방사선 조사와 함께 복합 치료에 의해 현저하게 억제되었다

우리는 KML001과 TMZ 또는 방사선 조사의 조합 치료가 GBM 세포 생존을 감소시키고 약물 감수성을 증가시키는 지 여부를 결정하기 위해 세포 콜로니 형성 분석을 수행했다. 이 분석은 단일 세포가 식민지로 성장할 수있는 능력을 바탕으로 한 시험 관내 clonogenicity test입니다. 단일 세포의 발암 가능성을 평가할 수있다 [25]. 콜로니 형성 분석에서 총 세포 수보다는 콜로니 수를 비교했다. 따라서 GBM 세포주가 다른 증식 률을 보였음에도 불구하고 증식 률은 분석 결과에 거의 영향을주지 않을 것이다 (보충 자료의 보충 자료 1 http://dx.doi.org/10.1155/2014/747415에서 온라인으로 이용 가능). 더욱이, GBM 세포가 접종 후 24 시간 이내에 거의 증식하지 않았기 때문에, 처리 전 차등 세포 증식은 결과에 영향을 미치지 않았다 (보충 그림 1).

결과적으로, KML001은 U251MG 및 U87MG GBM 세포의 TMZ에 대한 감도와 방사선 의존적 인 감응도 (그림 1)를 크게 증가 시킨다는 것을 확인했습니다. U251MG GBM 세포에서 8 μM KML001은 20 μM TMZ에서 3.8 배, 4 Gy 조사에서 3.6 배 감소했다 (그림 1 (a) 및 1 (c)). U87MG GBM 세포에서 0.1 μM KML001은 20 μM TMZ에서 6.7 배, 4 Gy 조사에서 5.0 배 감소했다 (그림 1 (b)와 1 (d)). U373MG (그림 2 (a)와 2 (c))와 U138MG (그림 2 (b)와 2 (d))와 같은 다른 GBM 세포주도 KML001과 비슷한 시너지 효과를 보였다.

이전의보고에 따르면, TMZ를 사용한 치료는 U87MG 이종 이식 종양의 실질적인 성장 지연을 일으켰지 만, 방사선 조사는 종양 성장에 영향을 미치지 못했다. 여기에서 우리는 TMZ가 U87MG 이종 이식에서의 조사보다 항암 효과가 더 높음을 확인했다. 또한, KML001은 U87MG 이종 이식 종양에 대한 TMZ의 항 종양 효과를 강화 시켰을뿐만 아니라 U87MG 세포의 생체 내 저항을 조사에 역전 시켰음을 확인했다. 종양 체적은 TMZ 또는 KML001의 단일 처치에 의해 감소되었지만, 정적으로 유의하지 않았다. 무 처리 그룹에 비해 KML001 및 TMZ (P = 0.001) 또는 방사선 조사 (P = 0.047)와의 병용 치료로 이종 이종 종양 만 유의하게 감소 하였다.




4. 결론

이 연구에서, 우리는 KML001이 in vitro 및 in vivo에서 GBM : TMZ 화학 요법 및 방사선 요법에 대한 통상적 인 세포 독성 치료의 항 종양 효과를 강화 시킨다는 것을 입증했다. 이러한 시너지 효과는 DNA 손상의 증가에 의해 매개 될 수 있으며, 이로 인해 GBM 세포의 세포 사멸이 더욱 촉진 될 수 있습니다. KML001만이 생체 내 전신성 독성을 보이지 않았기 때문에, KML001은 GBM 치료에서 조합 감작 약의 유력한 후보 물질이 될 수있다.