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유럽 특허 실시예 조회 : 467
gregori16 (49.1.***.26) 작성글 더보기
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등급 사또
2019/06/08 21:21 (수정 : 2019/06/08 21:31)
 
실시예 1

Identification of the Cancer Stem Cells in Cancer Cell Lines

암 세포주에 있는 암 줄기 세포의 식별

[0085] In this study, cancer stem cells (also referred to as the side population (SP)) and the ATP Binding Cassette (ABC) transporter defining the SP were identified in the following prostate cancer cell lines: DU145wt (parental), DU145/ Pac200 (paclitaxel resistant), and DU145/ Doc50 (docetaxel resistant).

[0085] 이 연구, 암 줄기 세포 ( 또한 참조한다에게 측면 개체군 ( SP ) 로서 )와 아데노신 3인산 바인딩 카세트 (ABC) 트랜스포터에서 SP가 다음 전립선암 세포주에서 확인한다는 것을 한정하는 것 : DU145wt (페어렌털), DU145/ Pac200 ( 파크리탁셀 레지스턴트 )와 DU145/ Doc50 ( 도세탁솔 레지스턴트 ).

[0086] All examined prostate cancer cell lines: DU145wt, DU145/ Pac200, DU145/ Doc50 exhibit a side population (Figures 1, 3, 5). Importantly, it was found that DU145/ Pac200 and DU145/ Doc50 cells have a very large side population (Figures 1, 5) of about 40 to 60% of their whole cell population consistent with our hypothesis that drug resistant cells can arise from cancer stem cells.

[0086] 모든 검사된 전립선암 세포주 : DU145wt, DU145/ Pac200, DU145/ Doc50은 측면 개체군 (도 1, 3, 5)를 나타낸다. 중요하게, DU145/ Pac200과 DU145/ Doc50 세포가 저항한 세포 드러그가 암 줄기 세포에서 비롯될 수 있는 우리 가설을 가진 지속적 그들 전체의 세포 집단의 약 40에서 60%의 극초대 측면 개체군을 ( 도 1, 5 ) 갖는 것은 발견되었다.

EXAMPLE 2

실시예 2

Sensitivity of Drug Resistant Cancer Stem Cells and Mature Cancer Cells to Sodium Meta Arsenite

나트륨 메타 아비산염에 대한 약물-내성 암 줄기 세포와 성숙한 암세포의 감도

[0087] Taxane resistant cell lines DU145/Pac200 (highly pacitaxel resistant) and DU145/Doc50 (highly docetaxel resistant) together with the parental cell line DU145 as well as the androgen resistant cancer cell lines (LNCaP/C81 and LAPC-4/CSS 100) and their corresponding hormone responsive parental cell lines (LNCaP and LAPC-4) were tested for their response to sodium meta arsenite. Growth curves from standard MTT assays showed that those cell lines respond with similar sensitivity to sodium meta arsenite regardless of their drug resistance (Table 1).

[0087] ( 고도로 저항하는 도세탁솔 ) 안드로겐 저항성 암 세포 라인 ( LNCaP / C81과 LAPC-4/CSS 100 )와 그들 상응하는 호르몬 민감한 모 세포 주 ( LNCaP와 LAPC-4 )뿐만 아니라 모 세포 주 DU145와 함께 탁산 저항하는 셀 라인 DU145/Pac200 (고도로 팍시탁셀 레지스턴트)과 DU145/Doc50은 나트륨 메타 아비산염에 대한 그들 응답을 위해 테스트되었다. 성장은 그 세포주가 비슷한 감도로 응답한다는 것을 보여진 표준 MTT 분석에서 그들 약물 내성 ( 테이블 1 )에 상관없이 나트륨 메타 아비산염을 만곡시킨다.

[0088] Each of the prostate cell lines was analyzed for the existence of a cancer stemlike cell fraction using DCV side population analysis. Side populations (SP) based on Dye Cycle Violet (DCV) dye efflux were identified in the drug resistant cell lines, confirming previous results using Hoechst 33342 dye for DU145/Doc50 (not shown). The occurrence of a SP is based on the expression of drug efflux pumps such as P-glycoprotein or BCRP, which are responsible for preventing standard cytotoxic therapy from working. The DU145 prostate cancer cell lines resistant against the standard chemotherapeutic agents paclitaxel and docetaxel had the highest SPs (Table 1). While the hormone resistant cell line LnCaP/C81 and its parental line also showed a clear side population that was suppressible with the drug efflux pump inhibitors verapamil (P-gP inhibitor) or fumitremorgin C (FTC, BCRP inhibitor), a definitive side population for LAPC-4 and its hormone resistant derivate were not detected by this method. Because the hormone therapies, e.g., androgen synthesis inhibitors, are not substrates of drug efflux pumps, these findings are not surprising. Table 1.Percentage of DCV side population in prostate cancer cell lines and in cells pre-treated with the PgP and BRCP transporter inhibitors (Verapamil and Fumitremorgin C, FTC), sensitivity to KML001, telomere length (TRF) and relative telomerase activity (TA).Cell lineSP %SP% with VerapamilSP% with FTCIC50 KML001 [?M]TRF Length [kbp]TA ratioDU1451.040.160.0642.71DU145/Pac200550.0756.5631.05DU145Doc5040.31.3518.3553.40.97LnCaP0.660.120.04431.18LnCaP/C810.160.070.1112.61.10LAPC-41.541.632.2446.71.27LAPC-4/CSS1000.360.190.3034.91.26

[0088] 전립선 세포주의 각각은 DCV 측면 개체군 분석을 이용하는 암 stemlike 셀 프랙션의 유/무를 위해 분석되었다. Hoechst 33342를 이용하는 이전 결과가 DU145/Doc50 ( 도시되지 않은 )를 위해 염색한다는 것을 확인함으로써, 염료 사이클 바이올릿 (DCV) 염료 유출에 기초가 된 측면 개체군 (SP)는 저항한 세포 드러그 라인에서 확인했다. SP의 발생은 p-글라이코프로틴 또는 BCRP와 같은 약물 유출 펌프의 표현에 기초가 되며, 그것이 표준 세포 독성 요법이 작동하는 것을 막 에 대해 책임지다. 표준 화학 요법제 파크리탁셀과 도세탁솔에 대하여 저항하는 DU145 전립선암 세포주는 가장 높은 SPs를 ( 테이블 1 ) 가졌다. 호르몬 저항하는 셀 라인 LnCaP/C81과 그것의 선조계가 또한 약물 유출 펌프 억제제 베라파밀 ( p-gp 억제제 ) 또는 푸미트레모르긴 C ( FTC, BCRP 억제제 )로 suppressible는 명백한 측면 개체군을 보여주는 반면에, LAPC-4와 그것의 호르몬 저항하는 파생물을 위한 결정적 측면 개체군은 이 방법에 의해 탐지되지 않았다. 호르몬 요법, 예를 들어, 안드로겐 합성 억제제가 약물 유출 펌프의 기판이 이 아니기 때문에, 이러한 발견은 놀라게 하지 않고 있다. PgP와 BRCP 전달체 억제제 ( 베라파밀과 푸미트레모르긴 C, FTC ), KML001에 대한 감도, 텔로미어 길이 (TRF) 그리고 관련된 텔로머라제 활성 (TA).Cell으로 미리 처리한 전립선암 세포주에서 그리고 셀에서 DCV 측면 개체군의 테이블 1.Percentage FTCIC50 KML001 [쨉M] TRF 길이 [ kbp ] TA ratioDU1451.040.160.0642.71DU145/Pac200550.0756.5631.05DU145Doc5040.31.3518.35 53.40.97LnCaP0.660.120.04431.18LnCaP/C810.160.070.1112.61.10LAPC-41.541.632.24를 가진 VerapamilSP%를 가진 lineSP %SP% 46.71.27LAPC-4/CSS1000.360.190.3034.91.26

EXAMPLE 3

실시예 3

Determination Of Telomerase Activity And Telomere Length In Drug Resistant Cancer Stem Cells

약물-내성 암 줄기 세포에 있는 텔로머라제 활성과 텔로미어 길이의 결정

[0089] In this study, it was determined that the highly paclitaxel and docetaxel resistant DU145/ Pac200 and DU145/ Doc50 lines have similar telomerase activity and telomere length compared to their parental, drug sensitive DU145 cells (Tab. 1). Table 1.IC50 Values for Taxanes and Telomere Length in Human Prostate Cancer Cell LinesPaclitaxelDocetaxelTAMean TRFNoCell LinesIC50 (?M)Resistance (fold)IC50 (?M)Resistance (fold)Ratio(kb)1DU145 wt0.002510.0005112.52DU145/Pac10N/AN/AN/AN/A0.793.03DU145/Pac2000.351400.24000.962.84Du145 Doc10N/AN/AN/AN/A1.12.25Du145 Doc501400120000.732.8TA = Telomerase activityTRF = Telomere Restriction Fragment

[0089] 이 연구에서, 고도로 파크리탁셀과 도세탁솔 레지스턴트 DU145/ Pac200과 DU145/ Doc50 라인이 비슷한 텔로머라제 활성과 텔로미어 길이를 그들 페어렌털, 약품 민감한 DU145 개의 셀 (탭 1)에 비교되게 한 것은 알아내였다. 테이블 1.IC50이 사람 전립선암 세포 LinesPaclitaxelDocetaxelTAMean TRFNoCell LinesIC50 (쨉M)저항 (fold)IC50 (쨉M)저항 (fold)Ratio(kb)1DU145 wt0.002510.0005112.52DU145/Pac10N/AN/AN/AN/A0.793.03DU145/Pac2000.351400.24000에 있는 택산과 텔로미어 길이에서.962.84Du145 Doc10N/AN/AN/AN/A1.12.25Du145를 높이 평가한다 Doc501400120000.732.8TA = 텔로머라아제 activityTRF = 텔로미어 제한 단편

EXAMPLE 4

실시예 4

The Effects of Verapamil on Drug Resistant Cancer Stem Cells

약물-내성 암 줄기 세포 위의 베라파밀의 효과

[0090] The SPs of Pac and Doc resistant DU145 cells were inhibited by verapamil, but not FTC, suggesting the Pgp (P-glycoprotein) is the predominant ABC transporter responsible for the occurrence of the SP (Fig. 1, 5). This was consistent with a high surface expression of Pgp by these cells as well as the prostate cancer specific stem cell marker CD44 ((Fig. 1B).

[0090] Pac과 Doc 저항하는 DU145 개의 셀의 SPs는 베라파밀에 의해 억제했지만, Pgp (p-글라이코프로틴)을 제안하지 못하는 것은 SP의 ( 도 1, 5 ) 발생에 대해 책임이 있는 우세한 ABC 트랜스포터아니다. 이것이 전립선암 특정한 줄기세포 표지자 CD44와 마찬가지로 이러한 셀에 의해 Pgp의 높은 표면 발현으로 지속적이었다 ( ( 도 1B ).

EXAMPLE 5

실시예 5

The Effects of KML001 and GRN163L Cancer Cells and Cancer Stem Cells

KML001과 GRN163L 암세포와 암 줄기 세포의 영향

[0091] In this study, the effects of the telomerase inhibitor KML001 (sodium meta arsenite) on DU145wt, DU145/ Pac200, and DU145/ Doc50 cells were compared with that of GRN163L, a telomerase inhibitor that is currently undergoing advanced clinical trials.

[0091] 이 연구에서, DU145wt, DU145/ Pac200과 DU145/ Doc50 개의 셀 위의 텔로머라제 억제제 KML001 (나트륨 메타 아비산염)의 효과는 현재 발전적 임상 실험을 겪고 있는 GRN163L, 텔로머라제 억제제의 그것으로 비교되었다.

[0092] MTT assays of DU145wt, DU145/Doc50 and DU145/ Pac200 treated with KML001 or GRN163L revealed marked inhibition of growth (Tab. 1, Fig. 1, 4). KML001 was equally effective in drug-resistant and parental DU145 cells (Tab. 1, Fig. ID)

[0092] KML001 또는 GRN163L으로 처리된 DU145wt, DU145/Doc50 및 DU145/ Pac200의 MTT 분석은 성장 (탭 1, 도 1, 4). KML001의 표시 억제형이 약물내성 및 부모의 DU145 개의 셀 ( 탭 1, 숫자 ID )에서 동등하게 효과적이었는지 나타냈다

EXAMPLE 6

실시예 6

The Effects Of Sodium Meta Arsenite And GRN 163 L On Cancer Stem Cells

나트륨 메타 아비산염과 GRN의 효과 암 줄기 세포 위의 163 L

[0093] In this study, the ability of sodium meta arsenite and GRN163L to eradicate the side population of DU145wt and DU145/ Pac200 when pre-treated at their IC100 for 48-72 hours were investigated.

[0093] 이 연구에서, 나트륨 메타 아비산염과 48-72 시간 동안 그들 IC100에 미리 처리할 때 DU145wt와 DU145/ Pac200의 측면 개체군을 근절하기 위한 GRN163L의 능력은 조사되었다.

[0094] This study demonstrated that DU145 and DU145/Pac200 cell pretreated with KML001 at a drug concentration that inhibits the growth of these cells to 100%, were capable of drastically reducing the SP (Fig. 3B, 5D). However, the mature cells (non-SP) were also eradicated. The specific (telomerase only) inhibitor GRN163L was used to validate effects of sodium meta arsenite on the SP. GRN 163 L also markedly reduced the SP, but was not able to kill non-SP cells to the same extent as KML001 (Fig. 5).

[0094] 증명된 이 연구 100%에 이러한 셀의 성장을 억제하는 약물 농도에서의 KML001으로 미리처리한 DU145와 DU145/Pac200 개의 셀이 SP (도 3B, 5D)를 감소시켜 과감하게 할 수 있었다. 그러나, 성숙 세포 (non-sp)는 또한 근절되었다. 특정한 ( 단지 텔로머라아제 ) 억제제 GRN163L이 또한 현저하게 감소된 SP. GRN 163 L 위의 나트륨 메타의 아비산염의 효과를 유효화하기 위해 이용되었고 SP, 그러나 KML001 ( 도 5 )로서 동일한 범위에 대한 비-sp 셀을 죽이기 위해 유능하지 않았다.

[0095] Overall, the data demonstrate that sodium meta arsenite is effective in eradicating both mature drug-resistant cancer cells and drug-resistant cancer stem cells.

[0095] 전체적으로, 데이터는 나트륨 메타 아비산염이 양쪽 성숙한 약물 내성 암세포와 약물내성 암 줄기 세포를 근절함에 있어 효과적인다고 증명한다.

EXAMPLE 7

실시예 7

Separation of SP in Drug resistant Cancer cell population/Response to KML001

KML001에 대한 약물-내성 암 셀 집단/응답에 있는 SP의 분리

[0096] All prostate cancer cell lines, taxane-resistant and androgen resistant cancer cell lines and hormone responsive parental cells respond with similar sensitivity to KML001 (IC50's of 1-6 ?M). The cancer cell lines that were resistant to paclitaxel and docetaxel were tested using a well-established tumor clonigenic stem cell assay for their response to KML001. (Figure 6) The assay allows only the cancer stem cell population to grow in a soft agar matrix owing to their self-renewal capability. Thus, this assay specifically tests the sensitivity of the stem cell population to an anti-cancer agent.

[0096] 모든 전립선암 세포주, 탁세인 내성 및 안드로겐 저항성 암 세포 라인 및 호르몬 민감한 부모의 셀은 KML001 (1-6 쨉M의의 IC50)에 비슷한 감도로 응답한다. 저항력이 있는 파크리탁셀과 도세탁솔인 암 세포주는에게 잘 확립되어 있는 종양 clonigenic 줄기세포 검사를 사용하여 테스트되었다. ( 도 6 ) 분석은 그들 셀프-리뉴얼 성능으로 인한 연한천 매트릭스에서 성장하기 위해 암 줄기 세포 집단만을 허용된다. 그러므로, 이 분석은 함암제에 특히 줄기 세포 집단의 감도를 테스트한다.

[0097] The plating efficiency of the cells (2% for DU145 and DU145/Pac200) was similar to the previously reported stem cell population determined in the side population assay (1 % for DU145 and 50% for DU145/Pac200). Similar sensitivity to KML001 for the parental as well as paclitaxel-resistant cell line was observed, as shown in a reduction of colony forming capability in the presence of KML001. A similar IC50 (6 ?M) for the cell lines in this assay was derived as for a standard MTT assay previously conducted (4?M for DU145 and 6?M for DU145/Pac200).

[0097] 셀 (DU145와 DU145/Pac200을 위한 2%)의 도금 효율은 측면 개체군 분석 ( DU145/Pac200을 위한 DU145와 50%를 위한 1 % )에서 알아낸 이전에 보고된 줄기 세포 집단과 유사했다. 파클릭탁셀 방지 세포주뿐만 아니라 페어렌털을 위한 KML001에 대한 비슷한 감도는 KML001의 존재의 콜로니집락 형성성의 성능의 리덕션에 도시된 바와 같이, 관찰되었다. 이 분석에 있는 세포주를 위한 비슷한 IC50 (6 쨉M)는 표준 MTT 분석 이전에 전도한 ( DU145를 위한 4쨉M과 DU145/Pac200을 위한 6쨉M )에 관해서 파생되었다.

[0098] Taxane resistant cell lines had the highest SPs, while the hormone responsive cell line LAPC-4 and its hormone resistant derivative showed a less definitive SP that was suppressible with the drug efflux inhibitors, verapamil (Pgp inhibitor) and fumitremorgin c (FTC, BCRP inhibitor). The SP positive cell line, DU145, was tested for the presence of CD44 and CD133 and the results showed 0.46% had both markers (data not shown).

[0098] 탁산 저항하는 셀 라인은 가장 높은 SPs를 가졌고, 반면에 호르몬 응답 세포 라인 LAPC-4와 그것의 호르몬 저항하는 유도체는 약물 유출 억제제, 베라파밀 ( Pgp 억제제 )와 푸미트레모르긴 c ( FTC, BCRP 억제제 )로 suppressible는 결정적 SP를 보여줬다. SP 양성 세포주, DU145는 CD44와 CD133의 존재를 위해 테스트되었고 결과는 0.46%가 양쪽 마커를 ( 도시되지 않은 데이터 ) 가지다는 것을 보여줬다.

[0099] The SP was separated from the bulk tumor mass and growth curves from a standard MTT assay showed that both fractions, the cancer stem cell-like SP positive (SP+) and negative (SP-) fraction, respond with similar sensitivity to KML001. (Figure 7)

[0099] SP가 벌크 종양 덩어리로부터 분리했고 성장이 표준 MTT 분석으로부터 만곡시키고 양쪽 프랙션, 암 스템 세포형 SP 포지티브 (SP+)와 부정적 (SP-) 프랙션이 KML001에 비슷한 감도로 응답한다는 것을 보여줬다. ( 도 7 )

EXAMPLE 8

실시예 8

Determination of telomere length, telomerase activity and hTERT activity

텔로미어 길이, 텔로머라제 활성과 hTERT 활동의 결정

[0100] As shown above (Example 3), the cancer stem cell-like fraction identified with the SP assay exhibited higher telomerase activity than the bulk cell fraction. Preliminary studies indicate that the mRNA transcript level of the catalytic subunit of the human telomerase (hTERT) is similar for both populations. (Figure 8A), which may indicate that the higher telomerase activity of the cancer stem cell-like population may be a result of stimulating signaling pathways by telomerase-associated proteins. Preliminary results in the unsorted DU145/Pac200 cell line indicate that KML001 treatment significantly decreases hTERT transcript level at the IC50 and IC100 after 72 hours. (Figure 8B)

[0100] (실시예 3) 위에 도시되기 때문에, SP 분석으로 확인한 암 스템 세포형 분획은 벌크 셀 프랙션보다 높은 텔로머라제 활성을 나타냈다. 예비적인 연구가 나타내고 인간 텔로머라아제 (hTERT)의 촉매 서브유니트의 mrna 전사물 레벨이 양쪽 집단을 위해 비슷하다. 나타낼 수 있는 ( 도 8A ) 암 스템 세포형 집단의 높은 텔로머라제 활성이 끝 분절 효소 연관 단백질에 의해 시그널화 경로를 자극하는 결과일 수 있다. DU145/Pac200 세포주가 나타내는 정렬되지 않은 것에 있는 예비적인 결과 KML001 가지의 처리가 72 시간 뒤에 현저하게 IC50과 IC100에서의 hTERT 전사체 수준을 감소시킨다. ( 도 8B )

[0101] The drug efflux pump (Pgp) is functionally expressed (at the membrane) in the majority of cells in the taxane-resistant prostate cancer cell lines, which is expected since the SP of those cell lines was suppressible with the drug efflux pump inhibitor verapamil. Treatment with KML001 at IC50 for 72 hours reduced the Pgp positive cell population, which corroborates the results of the clonogenic and SP assay.

[0101] 약물 유출 펌프 (pgp)가 ( 멤브레인에 ) 기능상으로 나타내진다 그 세포주의 SP가 약물 유출 펌프 억제제 베라파밀로 suppressible 기 때문에 예상된 탁세인 내성 전립선암 세포주에 있는 셀의 대부분에서. 감소된 72 시간 동안 IC50에서의 KML001을 가진 처리 클로노제닉 그리고 SP 분석의 결과를 확증한 Pgp 양성 세포 집단.

COMPARATIVE EXAMPLE 9

비교 실시예 9

[0102] The effect of cisplatin in the paclitaxel resistant prostate cancer cell line DU145/Pac200 as well as the parental cell line DU145 was examined in a standard MTT. The results show that both cell lines respond with similar sensitivity (IC50 of 3 and 4 ?M, respectively). Preliminary results indicate a synergistic effect between cisplatin and KML001 in the parental as well as paclitaxel resistant cell lines (results not shown).

[0102] 모 세포 주 DU145뿐만 아니라 파크리탁셀 저항하는 전립선암 세포주 DU145/Pac200에 있는 씨스플라틴의 효과는 표준 MTT에서 검사했다. 결과가 양쪽이 라인을 cell 보여주고 비슷한 감도 (3와 4 쨉M의 IC50, 각각)로 응답한다. 예비적인 결과는 페어렌털에서 파클리탁셀 저항하는 셀 라인으로 ( 도시되지 않은 결과 ) 씨스플라틴과 KML001 사이의 시너지 효과를 나타낸다.





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